上世紀(jì)50年代研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)了支原體污染，事實(shí)上細(xì)胞培養(yǎng)過程中支原體污染無處不在。綜合相關(guān)數(shù)據(jù)，細(xì)胞系支原體污染的平均比例為30-60%之間。細(xì)胞培養(yǎng)期間，建議定期進(jìn)行支原體檢測(cè)以防止污染。因此，迫切需要一種快速、全面的檢測(cè)方法以應(yīng)對(duì)支原體日常的檢測(cè)需求。

支原體的檢測(cè)有多種方法，傳統(tǒng)檢測(cè)方法和核酸檢測(cè)方法。

藥典中對(duì)支原體檢測(cè)的規(guī)定和要求

《中國(guó)藥典》<3301 支原體檢查法>采用了培養(yǎng)法和指示細(xì)胞培養(yǎng)法(DNA染色法)，中國(guó)藥典指出也可采用經(jīng)國(guó)家藥品檢定機(jī)構(gòu)認(rèn)可的其他方法。

檢查支原體采用支原體液體培養(yǎng)基和支原體半流體培養(yǎng)基(或支原體瓊脂培養(yǎng)基)。培養(yǎng)法是用液體或者半流體培養(yǎng)基培養(yǎng)7天后次代培養(yǎng)轉(zhuǎn)種培養(yǎng)21天，一共28天，觀察支原體是否生長(zhǎng)。

指示細(xì)胞培養(yǎng)法(DNA染色法)是將供試品接種于指示細(xì)胞中培養(yǎng)后，用特異熒光染料染色。如樣本有支原體污染，在熒光顯微鏡下可見附在細(xì)胞表面的支原體DNA著色。

《歐洲藥典》中<2.6.7>中指出，可通過使用特異性引物擴(kuò)增測(cè)試樣本中提取的核酸來檢測(cè)支原體，但需要進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。在適當(dāng)?shù)尿?yàn)證之后，核酸擴(kuò)增技術(shù)NAT可以代替培養(yǎng)法和指示細(xì)胞培養(yǎng)法。

支原體的核酸檢測(cè)方法

培養(yǎng)法和指示細(xì)胞培養(yǎng)法(DNA染色法)能很好地檢測(cè)生物制品或細(xì)胞中的支原體活菌，但耗時(shí)長(zhǎng)。翼和生物自主研發(fā)的3款支原體檢測(cè)試劑盒，均采用熒光定量qPCR方法定性檢測(cè)細(xì)胞或者生物制品中是否存在支原體污染，并且進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。

翼和生物支原體檢測(cè)試劑盒，采用雙色熒光qPCR(TaqMan探針法)檢測(cè)支原體DNA，檢測(cè)對(duì)象為細(xì)胞培養(yǎng)的上清液或細(xì)胞本身、血液、其他生物制品等。操作簡(jiǎn)便、快捷、方法特性符合要求。

細(xì)胞支原體檢測(cè)試劑盒方法學(xué)驗(yàn)證

翼和生物依據(jù)歐洲藥典推薦的核酸檢測(cè)支原體檢查法驗(yàn)證方案，對(duì)試劑盒的專屬性、線性范圍及檢測(cè)限、耐用性進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明，翼和生物細(xì)胞支原體檢測(cè)試劑盒這三方面特性均符合要求，配合核酸提取，檢測(cè)靈敏度可達(dá)到10 CFU/mL，可替代培養(yǎng)法，用于細(xì)胞存儲(chǔ)庫、細(xì)胞治療用途的細(xì)胞和生物制品中的支原體污染檢測(cè)，不同型號(hào)的試劑盒可用于日常檢測(cè)或者放行檢測(cè)。試劑盒使用時(shí)進(jìn)行適用性確認(rèn)即可。

適應(yīng)樣本類型和處理方案：

細(xì)胞培養(yǎng)上清、細(xì)胞懸液、血液，可用快檢直擴(kuò)方案

低溫保存的血清、臍帶血、胰酶、抗生素、未使用的 培養(yǎng)液等生物制品，即使存在支原體污染，一般支原體含量也較少，建議提取樣本DNA后檢測(cè)，可用快檢試劑盒。